HPLC| Laporan Praktikum Analisis Farmasi

PRAKTIKUM VI

PENETAPAN KADAR KAFEIN DALAM MINUMAN

BERENERGI DENGAN HPLC

A.    PELAKSANAAN PRAKTIKUM

1.      Tujuan Praktikum

a.       Untuk mengetahui prinsip dasar analisa sampel dengan alat HPLC

b.      Mampu mengidentifkasi dan menetapkan kadar kafein dalam suatu sampel

2.      Waktu Praktikum

Sabtu, 7 Oktober 2017

3.      Tempat Praktikum

Lantai III, Laboratorium Kimia Analitik, Fakultas Matematika dan Ilmu Pengetahuan Alam, Universitas Mataram.

B.     PRINSIP KERJA

Prinsip kerja alat HPLC adalah pemisahan komponan-komponen berdasarkan kepolarannya, artinya komponen pada suatu analit (sampel) akan terpisah berdasarkan sifat kepolaran masing-masing komponen dalam sampel, jika kepolarannya lebih mirip dengan fase diam, maka sampel akan berinteraksi dengan fase diam atau bergerak lebih lambat dan jika kepolarannya lebih mirip dengan fase gerak maka sampel akan bergerak terdistribusi lebih jauh dan lebih cepat. Dengan bantuan pompa fase gerak cair dialirkan melalui kolom detector (Hendayana, 2006).

C.     DASAR TEORI

HPLC atau KCKT (Kromatografi Cair Tingkat Tinggi) adalah teknik yang paling banyak digunakan untuk mengukur kantitas obat-obat dalam formulasi. Penentuan kadar dalam farmakope masih banyak didasarkan pada spektroskopi UV langsung, tatapi di industry, deteksi dengan spektrosmetri UV biasanya sikombinasikan dengan pemisahan pendahuluan dengan KCKT (Watson, 2013).

HPLC yang modern telah muncul akibat pertemuan dari kebutuhan, keinginan manusia untuk meminimalisir pekerjaan, kemampuan teknologi, dan teori untuk memandu pengembangan pada jalur yang rasional. Jelas sebelum era peralatan yang modern bahwa LC (Liquid Chromatography) memiliki kekuatan pemisahan yang sangat ampuh, bahkan untuk komponen-komponen yang berhubuangan sangat erat. LC harus ditingkatkan kecepatannya, diotomasasi, dan harus disesuaikan dengan sampel-sampel yang lebih kecil, waktu elusi yang beberapa jam (Underwood, 2002).

Dalam studi farmakokinetik, metode analisis kadar obat dalam sampel hayati merupakan kunci utama keberhasilan data. Beberapa metode analisis HPLC untuk menetapkan aspirin dan asam salisilat dalam plasma telah dikembangkan oleh banyak peneliti. Beberapa penelitian menggunakan metode HPLC untuk penetapan aspirin bersama dengan asam salisilat (Siswanto,dkk, 2016).

Metode HPLC dengan fase gerak methanol-buffer fosfat dan fase gerak methanol-buffer asetat dapat digunakan untuk pemisahan natrium sakarin, asam benzoat dan kafein. Kondisi optimum untuk fase gerak methanol-buffer fosfat adalah pH 4,5 dengan komposisi fase gerak 12,5 dan 87,5 dan sistem pendeteksian UV pada panjang gelombang 220 nm. Kondisi optimum untuk fase gerak methanol-buffer asetat adalah pH 5,5 dengan komposisi fase gerak 15:85 dan sistem pendeteksian UV pada panjang gelombang 230 nm.komposisi fase gerak methanol buffer asetat pH 5,5 (15:85) memberikan hasil yang lebih baik untuk pemisahan natrium sakarin, asam benzoate dan kafein dengan waktu retensi yang lebih pendek (Putra, 2017).

Metode dengan menggunakan HPLC yang diusulkan memungkinkan pemisahan pada 13 senyawa antara lain asam askorbat, asam nikotinat, asam pentolenat, piridoksin, nikotinamida, piridoksamin, riboflavin 5-fosfat (flavin mononukleotida), kafein, asam folat, sianokobalamin dan riboflavin dalam waktu yang relative singkat. Metode HPLC selektif untuk penentuan vitamin B2 dan B6 (Gliszczynska, 2014).

D.    ALAT DAN BAHAN

1.      Alat

a.       Blue tip

b.      Gelas Erlenmeyer

c.       Gelas ukur 50 ml

d.      HPLC series 200 dengan detector UV 254 nm perkin elmer

e.       Kolom: C18 (non polar)

f.       Label

g.      Labu ukur 50 ml

h.      Mikropipet

i.        Penyaring 0,45 µm

j.        Pipet volume 5 ml

k.      Rak tabung reaksi

l.        Rubber bulb

m.    Syringe

n.      Tabung reaksi

2.      Bahan

a.       Aquades (H₂O)

b.      Methanol (CH₃OH)

c.       Larutan standar (kafein murni) 100ppm

d.      Larutan standar (kafein murni) 200ppm

e.       Larutan standar (kafein murni) 300ppm

f.       Sampel Hemaviton

g.      Sampel Kratingdaeng

E.     PROSEDUR PERCOBAAN

     

F.  HASIL PENGAMATAN 

1.      Kurva standar kafein

a.   Standar kaffein 100 ppm

   

·         Tabel HPLC satndar cafein

Konsentrasi (ppm)	Waktu retensi	Area (πv* sec)	area	Height (eiv)	%Height
100 200 300	3,646 3,656 3,646	3458,670 5730,892 9306,385	81,36 80,77 94,85	196.488 334.292 486.995	81,68 81,70 94,88

Konsentrasi (ppm)	Waktu retensi	Area (πv* sec)	area	Height (eiv)	%Height
Hemaviton Kratingdaeng	3,608 3,659	4116.579 4702.505	30,19 35,34	178,782 191,688	36,04 41,97

G.    ANALISIS DATA

1.      Kurva Kalibrasi Standar

y    = ax + b

      = 3923x + 317601

R′  = 0,9837

2.      Konsentrasi sampel

 

 

H.    PEMBAHASAN

Pada praktikum kali ini terkait dengan kromatografi yaitu Kromatografi Cair Kinerja Tinggi (KCKT) atau lebih sering disebut HPLC. Teknik HPLC merupakan suatu metode kromatografi cair-cair yang dapat digunakan baik untuk keperluan pemisahan maupun analisis kuantitatif ( Wiji, 2010).

Pada praktikum kali ini dilakukan identifikasi kandungan kafein dalam  minuman berenergi yaitu sampel yang digunakan kratingdaeng dengan HPLC. Kafein adalah suatu senyawa berebntuk Kristal dan berasa pahit yang bekerja sebagai perangsang psikoaktif dan diuretik ringan.

Percobaan penentuan kadar kafein dalam sampel minuman dilakukan dengan analisa kualitatif dengan membandingkan waktu retensi standar. Sedangkan dengan cara analisa kuantitatif dilakukan dengan menghitung konsentrasi sampel  berdasarkan luas area puncak kromatogram dengan metode kurva kalibrasi dari larutan deret standar. Berdasarkan hasil yang diperoleh jika dibandingkan hasil kromatogram standar kafein dan kromatogram kafein sampel terdapat kemiripan waktu retensinya. Dimana waktu retensi pada konsentrasi 100 ppm, 200 ppm, 300 ppm secara berturut-turut yaitu 3,646 menit, 3,656 menit, 3,646 menit. Sedangkan pada sampel hemaviton sebesar 3,608 menit dan pada sampel kratingdaeng 3,659. Sehingga dapat dikatakan bahwa peak yang muncul timbul pada hasil pemisahan komponen kratingdaeng lebih tinggi mengandung kafein dibandingkan dengan hemaviton. Kemudian untuk menghitung konsentrasi kafein dalam sampel dilakukan terlebih dahulu dengan membuat kurva kalibrasi standar untuk memperoleh nilai x, diperoleh nilai a yaitu 3923, nilai b 317601 dan nilai r 0,9837. Nilai r tersebut mendekati angka 1 sehingga dapat dikatakan kurva membentuk garis linier. Hubungan konsentrasi dengan luas area yaitu berbanding lurus, semakin tinggi konsentrasi kafein maka semakin tinggi luas areanya, berdasarkan tabel hasil pengamatan.

Selanjutnya perhitungan konsentrasi sampel dilakukan dengan cara menggunakan persamaan y=29239 x + 317601 tadi berdasarkan kurva kalibrasi. Dimana nilai y dimasukkan angka luas area masing-masing sampel kafein yang waktu retensinya mirip dengan satndar, untuk kratingdaeng luas areanya sebesar 4702,505 sehingga nilai x untuk kratingdaeng yaitu 149,967 ppm. Sedangkan hemaviton areanya yaitu 4116579 sehingga nilai x yang didapat untuk hemaviton 129.928 ppm. Lalu dihitung faktor pengenceran, untuk hasil kedua sampel sama yaitu 3,3 ml dimana volume larutan 5 ml dan volume sampel 1:1,5. Setelah diperoleh nilai x dan faktor pengenceran maka dapat dilakukanperhitungan konsentrasi kafein pada sampel dengan cara mengkalinya. Pada kratingdaeng diperoleh hasil 74,1 mg/150  ml dan pada hemaviton sebesar 64,2 mg/150 ml. berdasarkan peraturan SNI 01-6684-2002. Bahwa kadar maksimum pada minuman berenergi adalah 50 mg persaji (BSN,2002). Sehingga pada hasil yang diperoleh tidak memeunhi syarat

Penggunaan HPLC bekerja bekerja dengan kepolarannya., artinya sampel akan terpisah berdasarkan sifatkepolaraannya dari masing-masing komponen dalam fase diam yang digunakan pada metode HPLC ini adalah kolom, injector, detector, pompa dan pengolah data. Fase gerak yang digunkan yaitu methanol 70% dan aquades 30%.

I.       KESIMPULAN

Berdasarkan tujuan praktikum,dapat disimpulkan bahwa:

1.      HPLC berprinsip pada pemisahan senyawa berdasarkan distribusi analit pada fase diam dan fase gerak dengan menggunakan tekanan. Fase geraknya, yaitu cairan atau pelarut organik dan fase diamnya, yaitu cairan atau padatan.

2.      Penetapan kadar kafein dalam sampel dapat dilakukan dengan membedakan kromatogram kafein standar dengan kromatogram kafein sampel dicari luas area yang sama atau menghitung konsentasi kadar kafein dala sampel, dan diperoleh hasil untuk kratingdaeng 74,1 mg/100 ml dan hemaviton 64,2 mg/150 ml

3.      Hubungan konsentrasi dengan luas area yaitu berbanding lurus. Emakin tinggi konsentrasi kafein maka semakin tinggi luas areanya. .

DAFTAR PUSTAKA

Gliszczynska, anna dan Rybika, 2014. Simultaneous Determination of Caffeine and Water-Soluble Vitamins in Energy Drintis by HPLC with Photodiote Array and Fluorosence Detection. Poland: Poznan University of Economics.

Hendayana, Sumar. 2006. Kimia Pemisahan Metode Kromatografi dan Elektroforesis Modern. Bandung: PT Remaja Rosdakarya.

Putra, Y Arif. 2017. Pemisahan Bahan Tambahan Pangan menggunakan Metanol-Buffer Fosfat dan Metanol Buffer Asetat. Pekanbaru: Universitas Islam Riau.

Siswanato, Agus, dkk. 2016. Validasi Metode HPLC untuk Penetapan Aspirin dan Asam Salisilat dalam Plasma Kelinci (Lepus curpaezems) secara Simultan. Yogyakarta: UGM.

Underwood. 2002. Analisis Kimia Kuantitatif. Jakarta: Erlangga.

Watson, David G. 2-13. Analisis Farmasi. Jakarta: EGC.

Wiji, dkk. 2010. Analisis Kafein dengan Alat HPLC. Jakarta: Universitas Indonesia.